人硫酸褪黑色素(MS)ELISA 試劑盒的應(yīng)用及操作步驟！
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 試劑盒的應(yīng)用及操作步驟！
一、背景
人硫酸褪黑色素(ms)elisa試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中硫酸褪黑色素(ms)的含量。
檢測(cè)原理：本試劑盒采用雙抗體夾心elisa法。用硫酸褪黑色素(ms)抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的硫酸褪黑色素(ms)會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的硫酸褪黑色素(ms)抗體，hrp-鏈霉親和素結(jié)合物,最后加入單組份tmb底物液。tmb在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)od值，硫酸褪黑色素(ms)濃度與od450值之間呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中硫酸褪黑色素(ms)的濃度。
二、樣品收集
1、血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。
2、血漿：抗凝劑推薦使用edta-na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。
3、組織勻漿：用預(yù)冷的pbs(0.01m,ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9ml的pbs，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
4、細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。
三、操作步驟
1、使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2、根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3、加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4、甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5、每孔加入100ul的親和鏈酶素-hrp，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6、甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7、每孔加入底物a、b各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8、取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9、在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值。
四、應(yīng)用
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 試劑盒可用于高血壓病證型與血清褪黑色素水平的相關(guān)性研究：
觀察血清褪黑素水平在高血壓病分級(jí)、危險(xiǎn)分層、不同證型、主要癥狀間的差異,探討其與高血壓病以及證型是否具有相關(guān)性。
方法：收集病人244例受試者,其中高血壓病患者184例,正常組60例。根據(jù)觀察表詢(xún)問(wèn)患者主要臨床癥狀,根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)將高血壓病分為肝陽(yáng)上亢、肝腎陰虛、陰陽(yáng)兩虛、氣虛痰濁四個(gè)證型。收集患者家庭自測(cè)血壓登記本,約患者上午8：00~9：00進(jìn)行血壓檢測(cè),并采集患者血液標(biāo)本,常溫下放置1小時(shí),離心血液標(biāo)本,提取血清,并做好冷凍保存。運(yùn)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人褪黑素水平,觀察褪黑素水平在四個(gè)證型、主要癥狀間、高血壓病分級(jí)、高血壓病危險(xiǎn)分層間的的差異。
結(jié)果：
1、184例高血壓病患者按照觀察表中所列23個(gè)癥狀中,大于40%的主要有10個(gè)癥狀,分別為眩暈、健忘、夜尿頻、氣短、腰酸、失眠多夢(mèng)、耳鳴、口干、頭痛、胸悶,五名的為眩暈（63.5%）、健忘（60.8%）、夜尿頻（55.9%）、腰酸（47.2%）、失眠多夢(mèng)（47.2%）。
2、根據(jù)高血壓病患者有無(wú)頭暈、健忘、夜尿頻、氣短、腰酸、耳鳴、口干、頭痛、胸悶等10個(gè)癥狀分為2組,比較組間褪黑素差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示均p值大于0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)患者臨床癥狀積分進(jìn)行分組（癥狀積分≤10和癥狀積分＞10）,兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3、對(duì)184例高血壓病患者的基本情況即性別、年齡、家族史（表3-表5）,進(jìn)行分組,比較組間褪黑素水平差異,其中性別組別、家族史組別血清褪黑素水平差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但年齡組別中,年齡小于40歲年齡組與40~60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。年齡小于40歲組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40~60歲年齡組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.02＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
4、對(duì)高血壓病患者患病年限、高血壓病血壓分級(jí)、高血壓病危險(xiǎn)分層、血壓控制是否達(dá)標(biāo)以及采集標(biāo)本時(shí)所測(cè)的血壓值與褪黑素水平的相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,研究結(jié)果（表6-表11）表明正常對(duì)照組、高血壓病患病年限（n）≤1兩組分別與n＞1（1＜n≤5、5＜n≤10、n＞10）的其他3組相比,血清褪黑素水平均高于后3組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n＞1的3組血清褪黑素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高血壓病1級(jí)、正常組與2級(jí)、3級(jí)組進(jìn)行比較,p＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2級(jí)與3級(jí)比較,p＞0.05,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組與高血壓病1級(jí)比較,p＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低危組、正常組分別與中、高、很高危3組比較,p＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各組兩兩進(jìn)行t檢驗(yàn),p＞0.05,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血壓控制達(dá)標(biāo)與否與褪黑素水平間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采集標(biāo)本時(shí)所測(cè)的舒張壓、收縮壓與褪黑素水平無(wú)相關(guān)性。
5、正常對(duì)照組及氣虛痰濁組褪黑素水平均高于肝陽(yáng)上亢、陰陽(yáng)兩虛、肝腎兩虛組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組與氣虛痰濁組褪黑素水平差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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一、背景
人硫酸褪黑色素(ms)elisa試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中硫酸褪黑色素(ms)的含量。
檢測(cè)原理：本試劑盒采用雙抗體夾心elisa法。用硫酸褪黑色素(ms)抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的硫酸褪黑色素(ms)會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，然后依次加入生物素化的硫酸褪黑色素(ms)抗體，hrp-鏈霉親和素結(jié)合物,最后加入單組份tmb底物液。tmb在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)od值，硫酸褪黑色素(ms)濃度與od450值之間呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中硫酸褪黑色素(ms)的濃度。
二、樣品收集
1、血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。
2、血漿：抗凝劑推薦使用edta-na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。
3、組織勻漿：用預(yù)冷的pbs(0.01m,ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9ml的pbs，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
4、細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。
三、操作步驟
1、使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2、根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3、加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4、甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5、每孔加入100ul的親和鏈酶素-hrp，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6、甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7、每孔加入底物a、b各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8、取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9、在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值。
四、應(yīng)用
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 試劑盒可用于高血壓病證型與血清褪黑色素水平的相關(guān)性研究：
觀察血清褪黑素水平在高血壓病分級(jí)、危險(xiǎn)分層、不同證型、主要癥狀間的差異,探討其與高血壓病以及證型是否具有相關(guān)性。
方法：收集病人244例受試者,其中高血壓病患者184例,正常組60例。根據(jù)觀察表詢(xún)問(wèn)患者主要臨床癥狀,根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)將高血壓病分為肝陽(yáng)上亢、肝腎陰虛、陰陽(yáng)兩虛、氣虛痰濁四個(gè)證型。收集患者家庭自測(cè)血壓登記本,約患者上午8：00~9：00進(jìn)行血壓檢測(cè),并采集患者血液標(biāo)本,常溫下放置1小時(shí),離心血液標(biāo)本,提取血清,并做好冷凍保存。運(yùn)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人褪黑素水平,觀察褪黑素水平在四個(gè)證型、主要癥狀間、高血壓病分級(jí)、高血壓病危險(xiǎn)分層間的的差異。
結(jié)果：
1、184例高血壓病患者按照觀察表中所列23個(gè)癥狀中,大于40%的主要有10個(gè)癥狀,分別為眩暈、健忘、夜尿頻、氣短、腰酸、失眠多夢(mèng)、耳鳴、口干、頭痛、胸悶,五名的為眩暈（63.5%）、健忘（60.8%）、夜尿頻（55.9%）、腰酸（47.2%）、失眠多夢(mèng)（47.2%）。
2、根據(jù)高血壓病患者有無(wú)頭暈、健忘、夜尿頻、氣短、腰酸、耳鳴、口干、頭痛、胸悶等10個(gè)癥狀分為2組,比較組間褪黑素差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示均p值大于0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)患者臨床癥狀積分進(jìn)行分組（癥狀積分≤10和癥狀積分＞10）,兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3、對(duì)184例高血壓病患者的基本情況即性別、年齡、家族史（表3-表5）,進(jìn)行分組,比較組間褪黑素水平差異,其中性別組別、家族史組別血清褪黑素水平差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但年齡組別中,年齡小于40歲年齡組與40~60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。年齡小于40歲組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.001＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。40~60歲年齡組與年齡＞60歲年齡組比較,p=0.02＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
4、對(duì)高血壓病患者患病年限、高血壓病血壓分級(jí)、高血壓病危險(xiǎn)分層、血壓控制是否達(dá)標(biāo)以及采集標(biāo)本時(shí)所測(cè)的血壓值與褪黑素水平的相關(guān)性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,研究結(jié)果（表6-表11）表明正常對(duì)照組、高血壓病患病年限（n）≤1兩組分別與n＞1（1＜n≤5、5＜n≤10、n＞10）的其他3組相比,血清褪黑素水平均高于后3組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n＞1的3組血清褪黑素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高血壓病1級(jí)、正常組與2級(jí)、3級(jí)組進(jìn)行比較,p＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2級(jí)與3級(jí)比較,p＞0.05,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組與高血壓病1級(jí)比較,p＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低危組、正常組分別與中、高、很高危3組比較,p＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各組兩兩進(jìn)行t檢驗(yàn),p＞0.05,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血壓控制達(dá)標(biāo)與否與褪黑素水平間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采集標(biāo)本時(shí)所測(cè)的舒張壓、收縮壓與褪黑素水平無(wú)相關(guān)性。
5、正常對(duì)照組及氣虛痰濁組褪黑素水平均高于肝陽(yáng)上亢、陰陽(yáng)兩虛、肝腎兩虛組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組與氣虛痰濁組褪黑素水平差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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