PI3K/Akt/mTOR信號通路
目的：通過特異性阻斷pi3k和mtor，觀察hepg2和hep3b細胞株pi3k/akt/mtor信號通路活性及生物學行為的改變，探討相關的分子機制。
方法：在培養(yǎng)的hepg2、hep3b人肝癌細胞株和人正常肝細胞株qsg-7701上，以免疫印跡方法（western blot）檢測各細胞株中pi3k（p110α亞單位）、pten、pakt（s473，t308）和p-mtor（s2448）的表達情況；分別用 pi3k抑制劑ly294002（50μmol/ml）和mtor抑制劑rapamycin（rapa，50 nmol/ml）孵育hepg2和hep3b細胞，以mtt比色法檢測細胞的增殖能力，以流式細胞術（flow cytometry）檢測細胞周期和凋亡情況，以western blot法檢測細胞中pakt（s473，t308）和p-mtor（s2448）的表達改變。
結果：pten在hepg2和hep3b細胞中基本無表達，在qsg-7701細胞株中高表達，pakt和p-mtor在hepg2和hep3b細胞中的 表達較qsg-7701細胞均顯著升高；ly294002和rapa均呈劑量-時間依賴的抑制hepg2和hep3b細胞生長。飽和效應濃度的 ly294002和rapa作用24小時后，hepg2和hep3b細胞均呈現明顯的g0/g1期阻滯，處于s期的細胞比例較對照組顯著減少 （p<0.01）；兩給藥組中hepg2細胞和hep3b細胞的凋亡率與對照組比較均顯著增加（p<0.01）；兩給藥組hepg2細胞的凋 亡率顯著高于hep3b細胞（p<0.01或p<0.05），并且hepg2細胞的凋亡率在rapa給藥組顯著高于ly294002給藥組 （p<0.01），但hep3b細胞的凋亡率在兩組間無顯著差異。飽和效應濃度的ly294002作用48小時后，hepg2和hep3b細胞中 pakt（t308，s473）和p-mtor（s2448）的表達水平較對照組均顯著降低（p<0.01），飽和效應濃度的rapa作用48小時 后，hepg2和hep3b細胞中p-mtor（s2448）的表達水平較對照組均顯著降低（p<0.01），而pakt（t308，s473）的 表達水平較對照組均顯著升高（分別p<0.01）。
結論：（1）hepg2和hep3b細胞存在pi3k/akt/mtor信號通路的組成性激活；（2）ly294002和rapa能有效阻斷hepg2和 hep3b細胞pi3k/akt/mtor信號通路，抑制hcc細胞的生長增殖，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，且阻斷效應與hcc細胞p53的表達有 關；（3）一定濃度范圍內，hepg2細胞對阻斷劑的敏感性高于hep3b細胞，rapa對pi3k/akt /mtor信號通路的部分阻斷效應優(yōu)于ly294002。
目的：觀察*（doxorubicin，dox）單用或與rapa聯合用藥對hepg2和hep3b細胞生物學行為及活性的影響，探討mtor抑制劑增強hcc*藥物療效的相關作用機制。
方法：分別取對數生*的hepg2和hep3b細胞，以不同濃度的dox單用或與rapa（20 nmol/ml）聯合應用培養(yǎng)48h或24h，以mtt法測定藥物對hepg2和hep3b細胞的增殖抑制作用，以流式細胞技術檢測二者的凋亡情況，以 western blot法檢測者p-p70s6k（t389）、p-4e-bp1（s65）和ps6（s235/236）的表達改變。
結果：0.156～2.5 mg/l濃度范圍內，dox能抑制hepg2和hep3b細胞的增殖，且呈濃度依賴性；dox在0.625～10mg/l濃度范圍內，hep3b細胞的相 對存活率顯著大于hepg2細胞（p<0.01）；與dox單用比較，dox（0.156～2.5mg/l）與rapa聯用顯著降低了hepg2和 hep3b細胞的存活率（p<0.01或p<0.05），dox（0.156～10mg/l）與rapa聯用，hep3b細胞存活率顯著大于 hepg2細胞（p<0.01）。dox（0.156～10mg/l）單用或與rapa聯用24h均可誘導hepg2和hep3b細胞凋亡發(fā)生，且 隨dox濃度增加，凋亡牢升高；與dox單用比較，dox（1.25～10mg/l）與rapa聯用，hepg2細胞捌亡率較顯著升高 （p<0.01或p<0.05），dox（2.5～10 mg/l）與rapa聯用，hep3b細胞凋亡率顯著升高（分別p<0.05）；dox（5.0～10mg/l）單用，hepg2細胞凋亡率顯著大 于hep3b細胞（分別p<0.05），dox（2.5～10 mg/l）與rapa聯用，hepg2細胞凋亡率顯著大于hep3b細胞（分別p<0.01）。rapa（20nmol/l）、dox（2.5mg /l）以及二者聯用均可導致hepg2或hep3b細胞p-p70s6k（t389）、p-4e-bp1（s65）和ps6（s235/236）表達減 少，且以dox與rapa聯用效應zui為明顯。
結論：（1）dox可抑制hepg2和hep3b細胞生長增殖，促進細胞凋亡，下調的活化程度；（2）dox與 rapa聯合用藥能顯著抑制hepg2和hep3b細胞的增殖，促進細胞凋亡，下調的活化程度，并在一定濃度范圍內表 現出協同效應；（3）在一定濃度范圍內，hepg2細胞對dox單用或與rapa聯合用藥的敏感性顯著高于hep3b細胞，可能與hcc細胞p53的表達 差異有關。
目的：分析人hcc組織中的活化水平與p53的表達及hcc臨床病理參數之間的關系，評估在hcc診斷和預后評價中的作用。
方法：76例hcc組織樣本經臨床病理分期分級后，以免疫組織化學方法檢測hcc組織和癌旁組織中p53、pakt、pten、p-mtor和ps6的表達情況，分析上述指標在不同hcc病理特征條件下的陽性表達率，并與正常肝組織比較。
結果：p53、pakt、pten、p-mtor和ps6在人hcc組織有不同程度的表達，hcc組織p53（60.5％，46/76）、 pakt（92.1％，70/76）、p-mtor（84.2％，64/76）和ps6（88.2％，67/76）的陽性表達比例較癌旁肝組織（分別為 10.5％，8/76、63.2％，48/76、46.1％，35/76、52.6％，40/76）和正常肝組織（分別為0％、55.0％，11/20、 50.0％，10/20、45.0％，9/20）顯著升高（p<0.01），而pten（65.8％，50/76）的陽性表達比例較癌旁肝組織 （89.5％，68/76）和正常肝組織（85.0％，17/20）顯著減少（p<0.05）；p53陽性表達hcc組織pakt、p-mtor和 ps6的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著升高（p<0.01），而pten的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著降低（p＜0.01）。低分 化、存在血管侵襲、tnm分期高的hcc組織p53、pakt、p-mtor和ps6的陽性表達率較相對應的分化較好、無血管侵襲、tnm分期低的hcc 組織顯著升高（分別p<0.01或p<0.05）；而pten的陽性表達率顯著降低（分別p<0.01或p<0.05）。
結論：（1）人hcc組織存在的激活；（2）人hcc組織的活化程度與p53的表 達可能有相關性；（3）人hcc組織的活化程度與hcc的臨床病理特征有關，活化程度越高的hcc其分化程度越低、血管侵襲多發(fā)、tnm分期高。
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安全性能綜合測試儀抗*力強
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PI3K/Akt/mTOR信號通路
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結果：pten在hepg2和hep3b細胞中基本無表達，在qsg-7701細胞株中高表達，pakt和p-mtor在hepg2和hep3b細胞中的 表達較qsg-7701細胞均顯著升高；ly294002和rapa均呈劑量-時間依賴的抑制hepg2和hep3b細胞生長。飽和效應濃度的 ly294002和rapa作用24小時后，hepg2和hep3b細胞均呈現明顯的g0/g1期阻滯，處于s期的細胞比例較對照組顯著減少 （p<0.01）；兩給藥組中hepg2細胞和hep3b細胞的凋亡率與對照組比較均顯著增加（p<0.01）；兩給藥組hepg2細胞的凋 亡率顯著高于hep3b細胞（p<0.01或p<0.05），并且hepg2細胞的凋亡率在rapa給藥組顯著高于ly294002給藥組 （p<0.01），但hep3b細胞的凋亡率在兩組間無顯著差異。飽和效應濃度的ly294002作用48小時后，hepg2和hep3b細胞中 pakt（t308，s473）和p-mtor（s2448）的表達水平較對照組均顯著降低（p<0.01），飽和效應濃度的rapa作用48小時 后，hepg2和hep3b細胞中p-mtor（s2448）的表達水平較對照組均顯著降低（p<0.01），而pakt（t308，s473）的 表達水平較對照組均顯著升高（分別p<0.01）。
結論：（1）hepg2和hep3b細胞存在pi3k/akt/mtor信號通路的組成性激活；（2）ly294002和rapa能有效阻斷hepg2和 hep3b細胞pi3k/akt/mtor信號通路，抑制hcc細胞的生長增殖，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，且阻斷效應與hcc細胞p53的表達有 關；（3）一定濃度范圍內，hepg2細胞對阻斷劑的敏感性高于hep3b細胞，rapa對pi3k/akt /mtor信號通路的部分阻斷效應優(yōu)于ly294002。
目的：觀察*（doxorubicin，dox）單用或與rapa聯合用藥對hepg2和hep3b細胞生物學行為及活性的影響，探討mtor抑制劑增強hcc*藥物療效的相關作用機制。
方法：分別取對數生*的hepg2和hep3b細胞，以不同濃度的dox單用或與rapa（20 nmol/ml）聯合應用培養(yǎng)48h或24h，以mtt法測定藥物對hepg2和hep3b細胞的增殖抑制作用，以流式細胞技術檢測二者的凋亡情況，以 western blot法檢測者p-p70s6k（t389）、p-4e-bp1（s65）和ps6（s235/236）的表達改變。
結果：0.156～2.5 mg/l濃度范圍內，dox能抑制hepg2和hep3b細胞的增殖，且呈濃度依賴性；dox在0.625～10mg/l濃度范圍內，hep3b細胞的相 對存活率顯著大于hepg2細胞（p<0.01）；與dox單用比較，dox（0.156～2.5mg/l）與rapa聯用顯著降低了hepg2和 hep3b細胞的存活率（p<0.01或p<0.05），dox（0.156～10mg/l）與rapa聯用，hep3b細胞存活率顯著大于 hepg2細胞（p<0.01）。dox（0.156～10mg/l）單用或與rapa聯用24h均可誘導hepg2和hep3b細胞凋亡發(fā)生，且 隨dox濃度增加，凋亡牢升高；與dox單用比較，dox（1.25～10mg/l）與rapa聯用，hepg2細胞捌亡率較顯著升高 （p<0.01或p<0.05），dox（2.5～10 mg/l）與rapa聯用，hep3b細胞凋亡率顯著升高（分別p<0.05）；dox（5.0～10mg/l）單用，hepg2細胞凋亡率顯著大 于hep3b細胞（分別p<0.05），dox（2.5～10 mg/l）與rapa聯用，hepg2細胞凋亡率顯著大于hep3b細胞（分別p<0.01）。rapa（20nmol/l）、dox（2.5mg /l）以及二者聯用均可導致hepg2或hep3b細胞p-p70s6k（t389）、p-4e-bp1（s65）和ps6（s235/236）表達減 少，且以dox與rapa聯用效應zui為明顯。
結論：（1）dox可抑制hepg2和hep3b細胞生長增殖，促進細胞凋亡，下調的活化程度；（2）dox與 rapa聯合用藥能顯著抑制hepg2和hep3b細胞的增殖，促進細胞凋亡，下調的活化程度，并在一定濃度范圍內表 現出協同效應；（3）在一定濃度范圍內，hepg2細胞對dox單用或與rapa聯合用藥的敏感性顯著高于hep3b細胞，可能與hcc細胞p53的表達 差異有關。
目的：分析人hcc組織中的活化水平與p53的表達及hcc臨床病理參數之間的關系，評估在hcc診斷和預后評價中的作用。
方法：76例hcc組織樣本經臨床病理分期分級后，以免疫組織化學方法檢測hcc組織和癌旁組織中p53、pakt、pten、p-mtor和ps6的表達情況，分析上述指標在不同hcc病理特征條件下的陽性表達率，并與正常肝組織比較。
結果：p53、pakt、pten、p-mtor和ps6在人hcc組織有不同程度的表達，hcc組織p53（60.5％，46/76）、 pakt（92.1％，70/76）、p-mtor（84.2％，64/76）和ps6（88.2％，67/76）的陽性表達比例較癌旁肝組織（分別為 10.5％，8/76、63.2％，48/76、46.1％，35/76、52.6％，40/76）和正常肝組織（分別為0％、55.0％，11/20、 50.0％，10/20、45.0％，9/20）顯著升高（p<0.01），而pten（65.8％，50/76）的陽性表達比例較癌旁肝組織 （89.5％，68/76）和正常肝組織（85.0％，17/20）顯著減少（p<0.05）；p53陽性表達hcc組織pakt、p-mtor和 ps6的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著升高（p<0.01），而pten的陽性表達率較p53陰性表達組織顯著降低（p＜0.01）。低分 化、存在血管侵襲、tnm分期高的hcc組織p53、pakt、p-mtor和ps6的陽性表達率較相對應的分化較好、無血管侵襲、tnm分期低的hcc 組織顯著升高（分別p<0.01或p<0.05）；而pten的陽性表達率顯著降低（分別p<0.01或p<0.05）。
結論：（1）人hcc組織存在的激活；（2）人hcc組織的活化程度與p53的表 達可能有相關性；（3）人hcc組織的活化程度與hcc的臨床病理特征有關，活化程度越高的hcc其分化程度越低、血管侵襲多發(fā)、tnm分期高。
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