GB 31659.2-2022 禽蛋、奶和奶粉中多西環(huán)素殘留量的測定
中華人民共和國國家標準
gb 31659.2-2022
食品安全國家標準禽蛋、奶和奶粉中多西環(huán)素殘留量的測定
液相色譜-串聯(lián)質譜法
national food safety standard-
determination of doxycycline residue in eggs，milk and milk powder
by liquid chromatography- tandem mass spectrometry method
1范圍
本文件規(guī)定了禽蛋、奶和奶粉中多西環(huán)素殘留量檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。
本文件適用于雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、牛奶粉、羊奶粉、牛奶和羊奶中多西環(huán)素殘留量的測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3術語和定義
本文件沒有需要界定的術語和定義。
4原理
試樣中殘留的多西環(huán)素，經mcllvaine-na2edta緩沖液提取，hlb柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，外標法定量。
5試劑和材料
5.1試劑
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.1.2乙腈（ch3cn）：色譜純。
5.1.3甲酸（hcooh）：色譜純。
5.1.4一水檸檬酸（c6h8o7·h2o）。
5. 1.5十二水磷酸氫二鈉（na2hpo3·12h2o）。
5.1.6二水乙二胺四乙酸二鈉（c10 h14n2na2o8·2h2o）。
5.1.7氫氧化鈉（naoh）。
5.2溶液配制
5.2.1氫氧化鈉溶液（1 mol/l）：取氫氧化鈉4 g，加水溶解并稀釋至100 ml，混勻。
5.2.2 mcllvaine-na2edta緩沖液：取一水檸檬酸12.9 g、十二水磷酸氫二鈉27.6 g、二水乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 ml使溶解，用氫氧化鈉溶液調ph至4.0±0.5，加水稀釋至1 000 ml，混勻。
5.2.3 0.1%甲酸溶液：取甲酸500μl，用水稀釋至500ml，混勻。
5.2.4 5%甲醇溶液：取甲醇5 ml，用水稀釋至100 ml，混勻。
5.2.5 30%甲醇溶液：取甲醇30 ml，用水稀釋至100 ml，混勻。
5.3標準品
鹽酸多西環(huán)素（doxycycline hydrochloride，c22h24n2o8·hcl，cas號：10592-13-9），含量≥98.7%。
5.4標準溶液制備
5.4.1標準儲備液：取鹽酸多西環(huán)素適量（相當于多西環(huán)素10mg），精密稱定，加甲醇適量使溶解并定容至10 ml容量瓶，配制成濃度為1 mg/ml的標準儲備液。-18℃以下保存，有效期1個月。
5.4.2標準中間液i：準確量取標準儲備液0.1 ml，于10 ml容量瓶，用30%甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為10μg/ml的標準中間液i。現用現配。
5.4.3標準中間液ii：準確量取中間液i 1.0 ml，于10 ml容量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為1 000 ng/ml的標準中間液ii?，F用現配。
5.4.4系列標準工作液：分別準確量取標準中間液i0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml于10 ml容量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成濃度分別為10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml、200 ng/ml的系列標準工作液?，F用現配。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：親水親脂平衡型固相萃取柱60mg/3ml。
5.5.2微孔尼龍濾膜：0.22μm。
5.5.3定性快速濾紙。
6儀器和設備
6.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配電噴霧離子源（esi）。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3渦旋混合器。
6.4渦旋振蕩器。
6.5高速冷凍離心機：轉速可達14 000 r/min。
6.6固相萃取裝置。
6.7氮吹儀。
7試樣的制備與保存
7.1試樣的制備
取適量新鮮的空白或供試禽蛋，去殼并均質。
取適量新鮮或解凍的空白或供試奶，混合均勻。
取適量新鮮的空白或供試奶粉，混合均勻。
a）取均質的供試樣品，作為供試試樣；
b）取均質的空白樣品，作為空白試樣；
c）取均質的空白樣品，添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試樣。
7.2試樣的保存
禽蛋、奶-18℃以下保存，奶粉常溫避光保存。
8測定步驟
8.1提取
禽蛋、奶：取試料2 g（準確至±0.05 g），于50 ml聚丙烯離心管中，加入mcllvaine-nag edta緩沖液8 ml，振蕩10 min，4℃下14 000 r/min離心10 min，吸取.上層液體于另一50 ml離心管中。用mcllvaine-na2edta緩沖液重復提取2次，每次8 ml，合并提取液，4℃下14 000 r/min離心10 min，取上清液備用（奶試樣上清液經濾紙過濾后備用）。
奶粉：取試料2 g（準確至士0.05 g），于50 ml聚丙烯離心管中，加入mcllvaine-na2edta緩沖液10 ml，振蕩10 min，4℃下14 000 r/min離心10 min，吸取上清液于另一50 ml離心管。用mcllvaine-na2edta緩沖液重復提取2次，每次10 ml，合并提取液，4℃下14 000 r/min離心10 min，上清液過濾紙后備用。
8.2凈化
取固相萃取柱，依次用甲醇、水各3 ml活化。取備用液，過柱，用水3 ml，5%甲醇3 ml淋洗，抽干，加甲醇3 ml洗脫，抽干，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹至液體小于1 ml，加30%甲醇至1.0 ml，渦旋混勻，過微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。
8.3基質匹配標準曲線的制備
準確移取系列標準工作液各100μl于經8.1~8.2步驟處理所得空白洗脫液中，40℃下氮氣吹至液體小于1 ml，加30%甲醇至1.0 ml，渦旋混勻，配制成濃度為1.0 ng/ ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml的系列基質匹配標準溶液，過微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。以多西環(huán)素特征離子質量色譜峰面積為縱坐標標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線。
8.4測定
8.4.1液相色譜參考條件
a）色譜柱：c18柱，柱長100 mm，內徑2.1 mm，粒徑1.7μm，或相當者；
b）流動相：a為乙腈，b為0. 1%甲酸溶液；
c）流速：0.3 ml/ min；
d）進樣量：10μl；
e）柱溫：30℃；
f）流動相梯度洗脫程序見表1。
8.4.2質譜參考條件
a）離子源：電噴霧離子源；
b）掃描方式：正離子掃描；
c）檢測方式：多反應離子監(jiān)測（mrm）；
d）離子源溫度：150℃；
e）脫溶劑溫度：450℃；
f）毛細管電壓：3.3 kv；
g）定性離子對、定量離子對及錐孔電壓和碰撞能量見表2。
8.4.3測定法
8.4.3.1定性測定
在同樣測試條件下，試料溶液中多西環(huán)素的保留時間與基質匹配標準工作液中多西環(huán)素的保留時間相對偏差在±2.5%以內，且檢測到的離子的相對豐度，應當與濃度相當的基質匹配標準溶液相對豐度一致。其允許偏差應符合表3的要求。
8.4.3.2定量測定
取試料溶液和基質匹配標準工作液，作單點或多點校準，按外標法以峰面積定量，基質匹配標準工作液及試料溶液中的多西環(huán)素響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。在上述色譜-質譜條件下，空白雞蛋基質匹配標準溶液特征離子質量色譜圖見附錄a。
8.5空白試驗
取空白試料，除不加藥物外，采用完全相同的測定步驟進行測定。
9結果計算和表述
試樣中多西環(huán)素的殘留量按標準曲線或公式（1）計算。
式中：
x——試樣中多西環(huán)素殘留量的數值，單位為微克每千克（μg/kg）；
cs——基質匹配標準溶液中多西環(huán)素濃度的數值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
ai——試樣溶液中多西環(huán)素峰面積；
v——溶解殘余物所用溶液體積的數值，單位為毫升（ml）；
as——基質匹配標準溶液中多西環(huán)素峰面積；
m——試樣質量的數值，單位為克（g）。
10檢測方法的靈敏度、準確度和精密度
10.1靈敏度
本方法的檢測限為1μg/kg，定量限為2μg/kg。
10.2準確度
本方法在2μg/kg~10μg/kg添加濃度水平上的回收率為60%~ 120%。
10.3精密度
本方法的批內相對標準偏差≤20%，批間相對標準偏差≤20%。
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gb 31659.2-2022
食品安全國家標準禽蛋、奶和奶粉中多西環(huán)素殘留量的測定
液相色譜-串聯(lián)質譜法
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by liquid chromatography- tandem mass spectrometry method
1范圍
本文件規(guī)定了禽蛋、奶和奶粉中多西環(huán)素殘留量檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。
本文件適用于雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、牛奶粉、羊奶粉、牛奶和羊奶中多西環(huán)素殘留量的測定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3術語和定義
本文件沒有需要界定的術語和定義。
4原理
試樣中殘留的多西環(huán)素，經mcllvaine-na2edta緩沖液提取，hlb柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，外標法定量。
5試劑和材料
5.1試劑
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.1.2乙腈（ch3cn）：色譜純。
5.1.3甲酸（hcooh）：色譜純。
5.1.4一水檸檬酸（c6h8o7·h2o）。
5. 1.5十二水磷酸氫二鈉（na2hpo3·12h2o）。
5.1.6二水乙二胺四乙酸二鈉（c10 h14n2na2o8·2h2o）。
5.1.7氫氧化鈉（naoh）。
5.2溶液配制
5.2.1氫氧化鈉溶液（1 mol/l）：取氫氧化鈉4 g，加水溶解并稀釋至100 ml，混勻。
5.2.2 mcllvaine-na2edta緩沖液：取一水檸檬酸12.9 g、十二水磷酸氫二鈉27.6 g、二水乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 ml使溶解，用氫氧化鈉溶液調ph至4.0±0.5，加水稀釋至1 000 ml，混勻。
5.2.3 0.1%甲酸溶液：取甲酸500μl，用水稀釋至500ml，混勻。
5.2.4 5%甲醇溶液：取甲醇5 ml，用水稀釋至100 ml，混勻。
5.2.5 30%甲醇溶液：取甲醇30 ml，用水稀釋至100 ml，混勻。
5.3標準品
鹽酸多西環(huán)素（doxycycline hydrochloride，c22h24n2o8·hcl，cas號：10592-13-9），含量≥98.7%。
5.4標準溶液制備
5.4.1標準儲備液：取鹽酸多西環(huán)素適量（相當于多西環(huán)素10mg），精密稱定，加甲醇適量使溶解并定容至10 ml容量瓶，配制成濃度為1 mg/ml的標準儲備液。-18℃以下保存，有效期1個月。
5.4.2標準中間液i：準確量取標準儲備液0.1 ml，于10 ml容量瓶，用30%甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為10μg/ml的標準中間液i。現用現配。
5.4.3標準中間液ii：準確量取中間液i 1.0 ml，于10 ml容量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為1 000 ng/ml的標準中間液ii?，F用現配。
5.4.4系列標準工作液：分別準確量取標準中間液i0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml于10 ml容量瓶中，用30%甲醇稀釋至刻度，混勻，配制成濃度分別為10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml、200 ng/ml的系列標準工作液?，F用現配。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：親水親脂平衡型固相萃取柱60mg/3ml。
5.5.2微孔尼龍濾膜：0.22μm。
5.5.3定性快速濾紙。
6儀器和設備
6.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配電噴霧離子源（esi）。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3渦旋混合器。
6.4渦旋振蕩器。
6.5高速冷凍離心機：轉速可達14 000 r/min。
6.6固相萃取裝置。
6.7氮吹儀。
7試樣的制備與保存
7.1試樣的制備
取適量新鮮的空白或供試禽蛋，去殼并均質。
取適量新鮮或解凍的空白或供試奶，混合均勻。
取適量新鮮的空白或供試奶粉，混合均勻。
a）取均質的供試樣品，作為供試試樣；
b）取均質的空白樣品，作為空白試樣；
c）取均質的空白樣品，添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試樣。
7.2試樣的保存
禽蛋、奶-18℃以下保存，奶粉常溫避光保存。
8測定步驟
8.1提取
禽蛋、奶：取試料2 g（準確至±0.05 g），于50 ml聚丙烯離心管中，加入mcllvaine-nag edta緩沖液8 ml，振蕩10 min，4℃下14 000 r/min離心10 min，吸取.上層液體于另一50 ml離心管中。用mcllvaine-na2edta緩沖液重復提取2次，每次8 ml，合并提取液，4℃下14 000 r/min離心10 min，取上清液備用（奶試樣上清液經濾紙過濾后備用）。
奶粉：取試料2 g（準確至士0.05 g），于50 ml聚丙烯離心管中，加入mcllvaine-na2edta緩沖液10 ml，振蕩10 min，4℃下14 000 r/min離心10 min，吸取上清液于另一50 ml離心管。用mcllvaine-na2edta緩沖液重復提取2次，每次10 ml，合并提取液，4℃下14 000 r/min離心10 min，上清液過濾紙后備用。
8.2凈化
取固相萃取柱，依次用甲醇、水各3 ml活化。取備用液，過柱，用水3 ml，5%甲醇3 ml淋洗，抽干，加甲醇3 ml洗脫，抽干，收集洗脫液，于40℃下氮氣吹至液體小于1 ml，加30%甲醇至1.0 ml，渦旋混勻，過微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。
8.3基質匹配標準曲線的制備
準確移取系列標準工作液各100μl于經8.1~8.2步驟處理所得空白洗脫液中，40℃下氮氣吹至液體小于1 ml，加30%甲醇至1.0 ml，渦旋混勻，配制成濃度為1.0 ng/ ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml的系列基質匹配標準溶液，過微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。以多西環(huán)素特征離子質量色譜峰面積為縱坐標標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線。
8.4測定
8.4.1液相色譜參考條件
a）色譜柱：c18柱，柱長100 mm，內徑2.1 mm，粒徑1.7μm，或相當者；
b）流動相：a為乙腈，b為0. 1%甲酸溶液；
c）流速：0.3 ml/ min；
d）進樣量：10μl；
e）柱溫：30℃；
f）流動相梯度洗脫程序見表1。
8.4.2質譜參考條件
a）離子源：電噴霧離子源；
b）掃描方式：正離子掃描；
c）檢測方式：多反應離子監(jiān)測（mrm）；
d）離子源溫度：150℃；
e）脫溶劑溫度：450℃；
f）毛細管電壓：3.3 kv；
g）定性離子對、定量離子對及錐孔電壓和碰撞能量見表2。
8.4.3測定法
8.4.3.1定性測定
在同樣測試條件下，試料溶液中多西環(huán)素的保留時間與基質匹配標準工作液中多西環(huán)素的保留時間相對偏差在±2.5%以內，且檢測到的離子的相對豐度，應當與濃度相當的基質匹配標準溶液相對豐度一致。其允許偏差應符合表3的要求。
8.4.3.2定量測定
取試料溶液和基質匹配標準工作液，作單點或多點校準，按外標法以峰面積定量，基質匹配標準工作液及試料溶液中的多西環(huán)素響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。在上述色譜-質譜條件下，空白雞蛋基質匹配標準溶液特征離子質量色譜圖見附錄a。
8.5空白試驗
取空白試料，除不加藥物外，采用完全相同的測定步驟進行測定。
9結果計算和表述
試樣中多西環(huán)素的殘留量按標準曲線或公式（1）計算。
式中：
x——試樣中多西環(huán)素殘留量的數值，單位為微克每千克（μg/kg）；
cs——基質匹配標準溶液中多西環(huán)素濃度的數值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
ai——試樣溶液中多西環(huán)素峰面積；
v——溶解殘余物所用溶液體積的數值，單位為毫升（ml）；
as——基質匹配標準溶液中多西環(huán)素峰面積；
m——試樣質量的數值，單位為克（g）。
10檢測方法的靈敏度、準確度和精密度
10.1靈敏度
本方法的檢測限為1μg/kg，定量限為2μg/kg。
10.2準確度
本方法在2μg/kg~10μg/kg添加濃度水平上的回收率為60%~ 120%。
10.3精密度
本方法的批內相對標準偏差≤20%，批間相對標準偏差≤20%。
共同分析農用植保無人機的市場需求
氣動橡膠密封不銹鋼板蝶閥D671XP氣動對夾不銹鋼板蝶閥的特點
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