第三代分子標(biāo)記snp在不同領(lǐng)域的應(yīng)用
基因檢測的目的是鑒定在基因組上對疾病或復(fù)雜性狀起作用的特殊因子,這種因子通常屬于堿基水平的變異,同時能穩(wěn)定遺傳給下一代,久而久之成為了不同人群的“遺傳標(biāo)志物”。在基因組學(xué)中,這種標(biāo)志物被稱為“dna分子標(biāo)記”,它們在人類基因組中數(shù)量頻密且功能特異。snp作為第三代分子標(biāo)記,被廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、法醫(yī)物證檢驗以及動植物育種等眾多領(lǐng)域。上一篇文章(不同snp檢測技術(shù)的原理—arms、kasp、taqman、分子信標(biāo)及hrm)我們介紹了snp分型檢測的幾種常用方法及其原理,今天我們就來了解一下snp的特點及基因分型在不同領(lǐng)域的應(yīng)用情況吧!
snp的特點
01分布廣、數(shù)量多snp是人類可遺傳變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。平均每五百到一千個堿基對就存在一個snp位點,估計其總數(shù)可達(dá)300萬個甚至更多。
02富有代表性當(dāng)snp發(fā)生在基因編碼區(qū)或基因的調(diào)節(jié)區(qū)域時,有可能直接影響蛋白結(jié)構(gòu)或者基因表達(dá),它們可能是疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素,且遺傳穩(wěn)定性高。
03易于分析snp所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異,這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所引起,也可由堿基的插入或缺失所致,所以一般認(rèn)為snp是二態(tài)性,從而有利于其進(jìn)行基因分型,而且可實現(xiàn)自動化。
snp應(yīng)用領(lǐng)域
1、腫瘤伴隨診斷伴隨診斷(cdx)主要通過檢測人體內(nèi)特異性蛋白或變異基因,結(jié)合藥物對在人體內(nèi)的代謝特點或作用靶點,幫助醫(yī)生評估某種藥物對患者的功效和安全性,對癥下藥,根據(jù)腫瘤患者特質(zhì),使用靶向藥進(jìn)行精準(zhǔn)治療。
腫瘤伴隨診斷作為伴隨診斷領(lǐng)域的細(xì)分賽道之一,新產(chǎn)品及新技術(shù)層出不窮。腫瘤的根源可以歸結(jié)為腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長,相比正常細(xì)胞,其最重要的不同是產(chǎn)生了驅(qū)使腫瘤發(fā)生的突變基因。國內(nèi)目前常見的腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因有12個:alk、egfr、kras、braf、pik3ca、ros1、her2、met、nras、ret、brca1、brca2,共計130+款獲證產(chǎn)品。主要集中在肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等大癌種領(lǐng)域,以肺癌為例,egfr基因突變是最常見的,egfr 的熱點敏感突變包括 19 號外顯子缺失突變(19del)及 21號外顯子 l858r點突變 ,其他如 20 號外顯子 s768i 點突變亦為已知敏感突變。
從技術(shù)角度分析,cdx可采用分子診斷、免疫組學(xué)、核磁共振等技術(shù),其中分子診斷是cdx的核心技術(shù),目前已獲證試劑盒情況來看,主要檢測方法為熒光pcr法、熒光原位雜交、測序法等。
2、藥物基因組學(xué)藥物基因組學(xué)通過研究與藥物反應(yīng)相關(guān)的基因變異、rna及蛋白質(zhì)特征,尋找與藥物反應(yīng)個體差異相關(guān)的基因多態(tài)性,闡明決定藥物反應(yīng)個體差異的根本機(jī)制,為臨床基因?qū)騻€體化治療提供理論依據(jù),實現(xiàn)個性化用藥。如維生素k氧化還原酶是抗凝藥物華法林的作用靶點。維生素k環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物 1的編碼基因vkorc1的遺傳變異可通過影響vkorc1表達(dá),從而影響華法林的敏感性。位于該基因啟動子區(qū)(-1639 g>a)的單核苷酸突變rs9923231可影響vkorc1的表達(dá),是導(dǎo)致華法林用藥劑量個體差異的主要原因之一。
《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南》里面推薦的檢測方法包括pcr-直接測序法、pcr-焦磷酸測序法、熒光定量pcr法、 pcr-基因芯片法、pcr-電泳分析、pcr-高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性pcr法、 pcr-限制性片段長度多態(tài)性方法、原位雜交(fish)等多種方法。從目前已獲證試劑盒情況來看,主流檢測方法為pcr熒光探針法、熒光pcr熔解曲線法等。
3、遺傳病檢測許多遺傳病是由點突變或者堿基片段插入缺失導(dǎo)致。研究數(shù)據(jù)表明,我國目前出生缺陷率為5.6%,約有22.2%的出生缺陷患兒是由單基因遺傳病導(dǎo)致,綜合發(fā)病率高達(dá)1/100,如臨床中常見的地中海貧血、先天性耳聾、白化病、家族性遺傳性腎炎、色盲、血友病等。
現(xiàn)有的出生缺陷防控體系可通過超聲等影像學(xué)手段篩查胎兒結(jié)構(gòu)畸形、通過nipt等技術(shù)篩查染色體異常。但是單基因遺傳病由于在胎兒發(fā)育期常常不表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)畸形,影像學(xué)檢查亦不易發(fā)現(xiàn)。因此,在孕早期或是備孕期進(jìn)行常見的單基因遺傳病調(diào)控基因的檢查,進(jìn)而實施有效的妊娠風(fēng)險評估與產(chǎn)前診斷,具有重要意義。
以地中海貧血為例,地中海貧血是一種單基因隱性遺傳病,是最常見的家族遺傳性疾病之一,輕型表現(xiàn)為貧血、脾大等,重型可導(dǎo)致妊娠婦女胎兒死亡、出生后死亡等。根據(jù)血紅蛋白中珠蛋白肽鏈?zhǔn)軗p的不同,地貧主要分為α地貧和β地貧兩類。目前地中海貧血基因檢測已獲證試劑盒30+個,以pcr技術(shù)為主,主流檢測方法為gap-pcr法、pcr+導(dǎo)流雜交法、熒光pcr溶解曲線法、pcr-熒光探針法等。
4、法醫(yī)snp分型snp由于其分布密度高、穩(wěn)定遺傳等特點,適用于人類起源、進(jìn)化、遷移的研究,也非常適用于法醫(yī)個體識別和親權(quán)鑒定,通過檢測這些遺傳標(biāo)記可以獲得更多的物證信息,為偵破案件提供幫助。
司法鑒定技術(shù)規(guī)范《法醫(yī)snp分型與應(yīng)用規(guī)范》指出snp分型結(jié)果可用于補(bǔ)充個人識別鑒定及輔助親緣關(guān)系鑒定。由于str片段長度相對較短,片段的退火溫度較為相似,便于實現(xiàn)多位點多重擴(kuò)增,并可實現(xiàn)全自動化,當(dāng)前的大型dna數(shù)據(jù)庫都是采用str技術(shù)建立起來的,所以str檢測技術(shù)仍是目前法醫(yī)dna檢測應(yīng)用最為廣泛的技術(shù),snp分型結(jié)果主要作為str結(jié)果的補(bǔ)充。
5、動物方向的應(yīng)用我國畜禽品種資源非常豐富,但本土種質(zhì)資源的開發(fā)利用率一直偏低。因此,開展遺傳資源基因組水平上的開發(fā)和利用是現(xiàn)代畜禽遺傳改良的重要方向之一。基于單核苷酸多態(tài)性(snp)的基因分型應(yīng)用,在商業(yè)化家畜繁育中的重要性正在日益突顯,其在功能基因的檢測、分子標(biāo)記輔助選擇及遺傳多樣性分析等方面發(fā)揮著重大作用。
由于過低的snp密度會影響性狀關(guān)聯(lián)標(biāo)記的挖掘效率,所以目前在畜禽育種領(lǐng)域,50k以上的中高密度snp基因芯片應(yīng)用較為廣泛,主要由illumina公司的infinium芯片技術(shù)平臺和thermo fisher公司的axiom芯片技術(shù)平臺定制生產(chǎn)。同時國內(nèi)也涌現(xiàn)出了一批院企聯(lián)合開發(fā)的芯片成果,如牧醫(yī)所與康普森等企業(yè)聯(lián)合開發(fā)的國內(nèi)款自主研發(fā)的肉雞基因組育種芯片“京芯一號”,打破了國外壟斷,推動國內(nèi)批自主培育白羽肉雞品種之一“廣明2號”的誕生。
隨著測序技術(shù)的迅猛發(fā)展和測序成本的超摩爾速度降低,基于二代測序的snp分型技術(shù)在畜禽分子育種領(lǐng)域應(yīng)用與日俱增。如簡化基因組測序分型技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于牛、豬、羊、雞、鴨等畜禽物種研究中,其中g(shù)bs (genotyping by sequencing)分型技術(shù)已經(jīng)被廣東溫氏公司應(yīng)用于杜洛克豬群體的基因組選擇育種研究,并取得了較為顯著的遺傳進(jìn)展。
在動物方向的應(yīng)用,涉及到的樣本量大、snp密度高,育種專家主要是借助基因組單核苷酸標(biāo)記(snp)芯片,通過全基因組關(guān)聯(lián)研究(gwas),進(jìn)而識別與復(fù)雜性狀和常見疾病關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記,促進(jìn)畜禽遺傳改良。
6、作物方向的應(yīng)用隨著時代的發(fā)展,豐富的分子標(biāo)記不斷被發(fā)現(xiàn),先后出現(xiàn)了以rflp,ssr,snp為代表的三代dna分子標(biāo)記。其中簡單重復(fù)序列(ssr,也被稱為微衛(wèi)星)和單核苷酸多態(tài)性(snps)已成為用于研究生物群體中的遺傳變異的分子標(biāo)記,被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、目標(biāo)性狀基因的標(biāo)記與定位、抗性育種、作物品種純度鑒定及品質(zhì)鑒定等方面。
像玉米、小麥、稻等主要經(jīng)濟(jì)作物都有相關(guān)國標(biāo)推薦的標(biāo)記物檢測方法,如gb/t 39914-2021《主要農(nóng)作物品種真實性和純度ssr分子標(biāo)記檢測 玉米》,目前國內(nèi)植物育種技術(shù),電泳檢測仍然為主流技術(shù)。
snp作為新一代分子標(biāo)記物,在作物領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增加。由于測序成本的大幅降低,基因芯片結(jié)合基因測序應(yīng)用也越來越廣泛,生物育種基因芯片利用國際前沿的功能基因組研究成果,挖掘水稻、油菜里海量的全基因組序列,在幾百萬個遺傳標(biāo)記中篩選出與抗病、抗蟲、抗旱、高肥效、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)等密切相關(guān)的分子標(biāo)記,經(jīng)過反復(fù)研究和驗證決選出有代表性的、能夠精準(zhǔn)檢測的單堿基多態(tài)性(snp)標(biāo)記,助力分子育種。這些少量的snp可以在大量樣本中進(jìn)行檢測,通常采用的技術(shù)如英國lgc(政府化學(xué)家實驗室)公司的kasp技術(shù),由于其高性價比及可搭配成套自動化設(shè)備,在作物育種領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。
目前也有一些國內(nèi)廠家在開發(fā)相應(yīng)的基因分型自動化設(shè)備,如瀚辰光翼的genematrix系統(tǒng)是目前擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的高通量基因分型系統(tǒng),四川杰萊美自主開發(fā)的qx 基因分型系統(tǒng)適用于kasp擴(kuò)增等。這些自動化設(shè)備的出現(xiàn),也必將使得snp分型在作物領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。
snp分型原料分享翌圣生物作為上游原料企業(yè),在分子酶領(lǐng)域深耕多年,目前已開發(fā)了arms-pcr法及taqman探針法的snp分型檢測通用原料,已被下游廠家應(yīng)用于腫瘤伴隨診斷、藥物基因組學(xué)、遺傳病檢測、疾病易感性研究等多個領(lǐng)域。
原料選擇指南
產(chǎn)品名稱
貨號
備注
2×hieff unicon®taqman snp genotyping master mix
13152es
taqman探針法
2×hieff®blood direct taqman qpcr master mix(low rox)
13095es
2×hieff unicon®multiplex arms qpcr mix
13755es
arms-pcr法
2×hieff unicon® multiplex arms qpcr kit
13229es
hieff unicon® hotstart super specific taq dna polymerase
14318es
單酶
10×taq pcr buffer(with mgcl2)
11373es
通用buffer
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