細(xì)胞傳代的時間老是掌握不好？這些經(jīng)驗(yàn)要知道！
養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴們都知道，細(xì)胞一定要傳代，因?yàn)榧?xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷的繁殖，數(shù)量也隨之增加，然而培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶的空間有限，增殖受到抑制，所以必須將一部分細(xì)胞移至別的培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞有足夠生長空間。
細(xì)胞傳代也不僅僅是為細(xì)胞安一個更大的“家”，更重要的，是使細(xì)胞系或細(xì)胞株進(jìn)一步增殖，這樣，我們才能有足夠的細(xì)胞做各種各樣的實(shí)驗(yàn)。
但是，對于傳代的時間，很多小伙伴都掌握不好，因?yàn)閷τ诓煌募?xì)胞來說，判斷能否開始傳代的標(biāo)準(zhǔn)略有不同，今天，我們就主要來聊一下，細(xì)胞傳代的時間問題。
什么時候進(jìn)行細(xì)胞傳代?
對于貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)而言，判斷是否需要傳代主要看以下2個方面：
細(xì)胞密度：
貼壁培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時即應(yīng)進(jìn)行傳代，正常細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時會停止生長(接觸抑制)，重新接種后需要較長時間才能恢復(fù)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使達(dá)到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖，但是在經(jīng)過大約兩個倍增時間后通常會變質(zhì)。類似地，
懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時也應(yīng)進(jìn)行傳代。達(dá)到匯合狀態(tài)時，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會聚集成團(tuán)塊，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶時培養(yǎng)基會變得渾濁。
培養(yǎng)基耗竭：
生長培養(yǎng)基ph值降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物。乳酸有細(xì)胞毒性，而且ph值降低也是細(xì)胞生長的不利因素。ph值改變的速度通常取決于培養(yǎng)體系中的細(xì)胞濃度，細(xì)胞濃度越高，培養(yǎng)基耗竭的速度越快。
如果發(fā)現(xiàn)ph值迅速降低(>0.1–0.2 ph單位)，同時細(xì)胞濃度增大，則應(yīng)對細(xì)胞進(jìn)行傳代。
細(xì)胞傳代時間安排
注意，一定要嚴(yán)格按照預(yù)定時間進(jìn)行細(xì)胞傳代，這樣才能確保細(xì)胞的生物學(xué)行為穩(wěn)定，便于監(jiān)測其健康狀態(tài)。
要從某一接種密度開始逐漸調(diào)整細(xì)胞接種密度，直到達(dá)到適合該細(xì)胞的穩(wěn)定生長速度和產(chǎn)量，細(xì)胞偏離如此確定的生長模式通常表示細(xì)胞健康狀況不佳(例如：變質(zhì)、污染)或者培養(yǎng)體系的某一組分功能異常(例如：未達(dá)到最,佳溫度，培養(yǎng)基過于陳舊)。
強(qiáng)烈建議大家保留詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)記錄，記錄加料和傳代時間、所用培養(yǎng)基種類、解離方法、分種率、形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果、接種濃度、產(chǎn)量和抗生素用法。
最,好按照傳代時間安排開展實(shí)驗(yàn)和其他非常規(guī)操作(如更換培養(yǎng)基種類)，如果您的實(shí)驗(yàn)安排與常規(guī)傳代時間安排不吻合，則應(yīng)確保當(dāng)細(xì)胞仍處于延滯期或者已經(jīng)達(dá)到匯合狀態(tài)、停止生長時，不進(jìn)行傳代。
貼壁細(xì)胞傳代流程:
以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代的一般流程,為自己所用的細(xì)胞系傳代時，建議您嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)中所有產(chǎn)品附帶的操作說明,偏離某種細(xì)胞所需的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致細(xì)胞表型異常，甚至培養(yǎng)完,全失敗。
(1)傳代前準(zhǔn)備
用具紫外照射消毒(30min)：無菌培養(yǎng)瓶，15ml離心管，移液管，移液槍，槍頭。
倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。
(2)胰,蛋白酶/edta消化
從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細(xì)胞(將蓋子擰緊)，75%酒精進(jìn)行瓶口消毒，吸掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基，pbs緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中edta濃度視不同細(xì)胞而定。放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi)，加入6ml細(xì)胞完,全培養(yǎng)基中止消化，消化時間為1-5min，具體以細(xì)胞而議，采用無菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有的細(xì)胞懸液放入干凈的15ml離心管內(nèi)，每分鐘1000rpm，rt5min。
(3)制備細(xì)胞懸液及培養(yǎng)
吸取上清液丟棄，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀，向離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀加入適量完,全培養(yǎng)基，吹打混勻，吹打過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡，以1:2的比例進(jìn)行分瓶。
(4)結(jié)果觀察
第二天觀察細(xì)胞情況，細(xì)胞培養(yǎng)換液時間一般2-3天。
(5)注意事項(xiàng)
1嚴(yán)格無菌
2適度消化：把握好消化液的最,佳濃度
3吹打細(xì)胞動作要輕柔
懸浮細(xì)胞傳代流程
懸浮細(xì)胞傳代就比較容易了，可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時，可以將懸液移到離心管內(nèi)，1000-1500rpm離心3min，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
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