細胞治療---檢測CAR-T細胞活化和殺傷效果
嵌合抗原受體（car）t細胞治療是適應(yīng)性免疫治療的前沿。car-t細胞是由t細胞設(shè)計而來的，通過促進癌細胞表面的相互作用來特異性地靶向腫瘤細胞。car-t細胞的激活導(dǎo)致了由car-t細胞產(chǎn)生的細胞因子和趨化因子產(chǎn)生的細胞信號通路的增加，以破壞靶向腫瘤細胞。這篇綜述旨在展示使用不同類型的檢測方法來檢測car-t或t細胞活化和殺傷靶腫瘤細胞的效果。
cd19特異性car-t治療，kymriah®和yescarta®分別治療急性淋巴細胞白血?。╝ll）和非霍奇金淋巴瘤，為臨床中具有更多car-t靶點的其他car-t治療打開了大門。到目前為止，主要成功的藥物是靶向血液惡性腫瘤。它比實體腫瘤更容易靶向，而實體腫瘤由于免疫抑制微環(huán)境而具有更高的屏障（wang et al.）。
car-t設(shè)計包括一個抗原結(jié)合位點、鉸鏈和間隔區(qū)，以及細胞內(nèi)激活域。第一代表達一個t細胞內(nèi)激活信號域（cd3ζ），而第三代現(xiàn)在通常表達共刺激域（cd28，或4-1bb）（androulla和lefkothea）。
一、car-t細胞活化
當(dāng)car-t細胞識別腫瘤抗原并與腫瘤細胞結(jié)合時，細胞因子、穿孔素和顆粒酶的釋放，會導(dǎo)致腫瘤細胞和周圍間質(zhì)中的細胞死亡（benmebrarek et al.）。這些細胞因子可包括ifnγ、tnfα、il-2和il-8。在模擬car-t治療的共培養(yǎng)體外模型系統(tǒng)中，可以在細胞上清液檢測到。
von scheidt等使用alphalisa檢測了在存在雙特異性cmyc/cd40抗體的共培養(yǎng)環(huán)境下，car-t細胞產(chǎn)生的ifnγ。cmyc標(biāo)簽僅存在于car-t細胞中，cd40在抗原提呈細胞（apcs）上表達，包括樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞和b細胞的亞群。在cd40+apcs通過流式細胞術(shù)和ifnγ釋放來檢測car-t細胞增殖，其對照組為未轉(zhuǎn)導(dǎo)car分子的僅包含c-myc tagged anti-her2。
copyright: von scheidt, b. et al. enterotoxins can support car t cells against solid tumors. pnas 116:50 (2019). figure reproduced with permissions granted by pnas.
二、car-t殺傷功能檢測
除了使用細胞因子的釋放來測量car-t細胞的活性外，對靶向腫瘤細胞群中特異性細胞裂解的檢測也顯示了car-t細胞的殺傷活性。delfia eutda細胞毒性試劑安全、快速的用batda試劑標(biāo)記靶細胞，一旦進入細胞，內(nèi)酯酶裂解batda底物形成tda，不能再穿過細胞膜屏障。標(biāo)記靶細胞的裂解釋放上清液中的tda，然后將其轉(zhuǎn)移到檢測板上，并與銪溶液結(jié)合生成熒光分子eutda。信號與靶細胞的死亡呈現(xiàn)正相關(guān)。
du s-h等使用delfia eutda細胞毒性試劑、raji和daudi細胞，比較了多種抗cd19 car分子的car-t細胞的殺傷功能。如下圖，相對于對照組mock和gfp car-ts，幾乎所有car分子均使得殺傷率顯著增加。證明了將car-t添加到t細胞亞群和提高細胞殺傷能力是有效的。
copyright: du s-h, li z, chen c, tan w-k, chi z, kwang tw, et al. (2016) co-expansion of cytokine-induced killer cells and vγ9vδ2 t cells for car t cell therapy. plos one 11(9): e0161820.
三、聯(lián)合免疫療法
免疫療法的另一種策略是尋找能增強t細胞活性的小分子或生物制劑。靶向ctla4或pd1途徑的檢查點抑制劑分子。檢查點抑制劑靶向t細胞上的抑制性受體，重新激活抗腫瘤免疫反應(yīng)（havel et al.）。
dextaras等依據(jù)上述思路篩選小分子，通過檢測t細胞活化的標(biāo)志物-ifnγ，使用htrf技術(shù)來篩選可以促使ifnγ分泌增加的小分子。
dexesas等人篩選了大約500種小分子。研究發(fā)現(xiàn)36個活性分子增加了ifnγ的分泌。這些結(jié)果通過正交分析，如細胞增殖，并通過qrt-pcr，最終得到4種化合物，認為可針對braf突變黑色素瘤患者進行下一步研究。
copyright: dextras, c. et al. (2020). identification of small molecule enhancers of immunotherapy for melanoma. scientific reports. 10:5688
體外car-t或t細胞的活化可以使用alphalisa和htrf等均相檢測技術(shù)檢測ifnγ來評估。方法簡單，靈敏，穩(wěn)定，以最少的樣本消耗最快的獲得結(jié)果。此外，共培養(yǎng)實驗中的靶細胞死亡可以使用delfia eutda細胞毒性試劑來檢測。穩(wěn)定的熒光替代更傳統(tǒng)的cr51釋放檢測。
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64pd1peg 免疫檢查點 pd1/pd-l1 500 tests
64sirppeg 免疫檢查點 cd47/sirpalpha 500 tests
64lag3peg 免疫檢查點 lag3/mhcii 500 tests
64ctla86peg 免疫檢查點 ctla4/cd86 500 tests
64ctla80peg 免疫檢查點 ctla4/cd80 500 tests
63adk000cb05peg 免疫檢查點 pd1/pd-l2 500 tests
63adk000cb06peg 免疫檢查點 4-1bb/4-1bbl 500 tests
63adk000cb07peg 免疫檢查點 tigit/cd155 500 tests
63adk000cb10peg 免疫檢查點 lag3/fgl1 500 tests
*以上產(chǎn)品提供500 tests和10000tests等規(guī)格
alphalisa®、htrf®和delfia®需要使用搭載有相應(yīng)模塊的酶標(biāo)儀進行讀值，優(yōu)寧維推薦perkinelmer victor nivo™ 多功能酶標(biāo)儀：
參考文獻
1.wang, z. et al. (2017). current status and perspectives of chimeric antigen receptor modified t cells for cancer treatment. protein cell, 8:896-925
2.androulla and lefkothea (2018). car t-cell therapy: a new era in cancer immunotherapy. current pharmaceutical biotechnology, 19 p5-18
3.benmebarek, m. et al. (2019). killing mechanisms of chimeric antigen receptor (car) t cells. international journal of molecular sciences, 20:1283
4.von scheidt, b. et al. (2019) enterotoxins can support car t cells against solid tumors. pnas 116:50.
5.du s-h, li z, chen c, tan w-k, chi z, kwang tw, et al. (2016) co-expansion of cytokine-induced killer cells and vγ9vδ2 t cells for car t cell therapy. plos one 11(9):
e0161820.
6.havel, j. et al. (2019) the evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. nat rev cancer 19(3): 133–150
7.dextras, c. et al. (2020). identification of small molecule enhancers of immunotherapy for melanoma. scientific reports. 10:5688
上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司
試劑 | 耗材 | 儀器 | 軟件 | 定制 | 實驗服務(wù) | 供應(yīng)鏈
微信公眾平臺：優(yōu)寧維抗體專家，歡迎關(guān)注！
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BXS-300 野外鉆孔水位計 300米水位測量
技術(shù)資訊 污水氨氮超標(biāo)原因分析及應(yīng)對措施
助力城市空氣質(zhì)量的溯源追蹤——車載式空氣質(zhì)量在線監(jiān)測系統(tǒng)
常州都盈科學(xué)修復(fù)管道-不銹鋼發(fā)泡筒法局部管道修補非開挖
《三亞市再生資源回收體系“十四五”發(fā)展規(guī)劃（2021—2025）》發(fā)布！
細胞治療---檢測CAR-T細胞活化和殺傷效果
一天100噸地埋式污水處理設(shè)備價位
不銹鋼反應(yīng)釜如何進行一些日常維護
GWL-PF屏蔽型保溫電伴熱帶
乙二醇螺桿式防爆制藥用冷水機
石膏砂漿塑性開裂監(jiān)測儀操作步驟
美華儀介紹自動水泥養(yǎng)護槽的特點
防爆二氧化碳充裝秤（電子地磅稱）不干膠打印臺秤 功能說明
KEM塑料拖鏈質(zhì)量的好壞與尼龍質(zhì)量有哪些關(guān)系呢？
飼料水分和顆粒飼料質(zhì)量的關(guān)系
泔水干濕分離
殺菌鍋特點
柱塞泵常見故障的維修方法
提高精度與可靠性：新型粉體流量計技術(shù)解析
污水處理系統(tǒng)設(shè)備有哪些？
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二、car-t殺傷功能檢測
除了使用細胞因子的釋放來測量car-t細胞的活性外，對靶向腫瘤細胞群中特異性細胞裂解的檢測也顯示了car-t細胞的殺傷活性。delfia eutda細胞毒性試劑安全、快速的用batda試劑標(biāo)記靶細胞，一旦進入細胞，內(nèi)酯酶裂解batda底物形成tda，不能再穿過細胞膜屏障。標(biāo)記靶細胞的裂解釋放上清液中的tda，然后將其轉(zhuǎn)移到檢測板上，并與銪溶液結(jié)合生成熒光分子eutda。信號與靶細胞的死亡呈現(xiàn)正相關(guān)。
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