淺談常見(jiàn)比色法蛋白質(zhì)定量分析方法
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如*，*)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有bca，bradford，lowry 等幾種方法。
lowry 法:以早期的biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與cu2 反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與biuret 相比，lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含edta，triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
bca(bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與cu2 反應(yīng)產(chǎn)生cu ，后者與bca形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
bradford 法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好，是lowry 和bca 兩種測(cè)試方法的2 倍;操作更簡(jiǎn)單，速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果;而且與一系列干擾lowry，bca 反應(yīng)的還原劑(如dtt，巰基乙醇)相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如:keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果lowry，bca 測(cè)出的濃度明顯高于bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。如用lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以bsa作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件-- 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品)，都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液ph值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的背景信息，設(shè)定此功能開(kāi)。與測(cè)試核酸類似，要求a280的吸光值至少大于0.1a，*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)漂移。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察a280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閣arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如dna的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
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力士樂(lè)比例閥保養(yǎng)從哪些方面入手
面條機(jī)的使用及保養(yǎng)事項(xiàng)
涂膜耐腐蝕性實(shí)驗(yàn)箱
比例閥PDBM12120APZ規(guī)格
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數(shù)顯拉力試驗(yàn)機(jī)報(bào)價(jià)
數(shù)控折彎?rùn)C(jī)價(jià)格一般多少-分類不同價(jià)格不同
談“霉”色變不可取 發(fā)酵食品看工藝
遠(yuǎn)傳液位計(jì)有什么依據(jù)？
優(yōu)安宏銀行對(duì)講IP網(wǎng)絡(luò)廣播解決方案
貼標(biāo)機(jī)的清潔流程
全自動(dòng)自清洗過(guò)濾器的安裝注意點(diǎn)
慢病防治智能體檢一體機(jī)
我們來(lái)看看新能源電池防爆高低溫一體機(jī)是做什么用的
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如*，*)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有bca，bradford，lowry 等幾種方法。
lowry 法:以早期的biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與cu2 反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與biuret 相比，lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含edta，triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
bca(bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與cu2 反應(yīng)產(chǎn)生cu ，后者與bca形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
bradford 法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好，是lowry 和bca 兩種測(cè)試方法的2 倍;操作更簡(jiǎn)單，速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果;而且與一系列干擾lowry，bca 反應(yīng)的還原劑(如dtt，巰基乙醇)相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如:keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果lowry，bca 測(cè)出的濃度明顯高于bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。如用lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以bsa作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件-- 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品)，都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液ph值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的背景信息，設(shè)定此功能開(kāi)。與測(cè)試核酸類似，要求a280的吸光值至少大于0.1a，*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)漂移。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察a280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閣arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如dna的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
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