過氧化物酶活性的測定方法
過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶,它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關(guān)系,在植物生長發(fā)育過程中,它的活性不斷發(fā)生變化,因此測量這種酶,可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化.
一、原理
在有過氧化氫存在下,過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化,生成茶褐色物質(zhì),該物質(zhì)在 470 nm 處有最大吸收,可用分光光度計測量 470 nm 的吸光度變化測定過氧化物酶活性.
二、實驗材料、試劑與儀器設備
（一）實驗材料
馬鈴薯塊莖.
（二）試劑
1 ． 100 mmol ／ l 磷酸緩沖液 ph6.0 （見附錄）.
2 ．反應混合液：100 mmol ／ l 磷酸緩沖液（ ph6.0 ） 50 ml 于燒杯中,加入愈創(chuàng)木酚 28 μl ,于磁力攪拌器上加熱攪拌,直至愈創(chuàng)木酚溶解,待溶液冷卻后,加入 30 % 過氧化氫 19 μl ,混合均勻,保存于冰箱中.
（三）儀器設備
分光光度計,研缽,恒溫水浴鍋,100 ml 容量瓶,吸管,離心機.
三、實驗步驟
1 ．稱取植物材料 1 g ,剪碎,放入研缽中,加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿,以 4000 r ／ min 離心 15 min ,上清液轉(zhuǎn)入 100 ml 容量瓶中,殘渣再用 5 ml 磷酸緩沖液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,貯于低溫下備用.
2 ．取光徑 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反應混合液 3 ml 和磷酸緩沖液 1ml ,作為對照,另 1 只中加入反應混合液 3 ml 和上述酶液 1ml （如酶活性過高可稀釋之）,立即開啟秒表記錄時間,于分光光度計上測量波長 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 讀數(shù)一次.
四、結(jié)果計算
以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小,即以 δa 470 /[min ? g （鮮重） ] 表示之.也可以用每 min 內(nèi) a 470 變化 0.01 為 1 個過氧化物酶活性單位（ u ）表示.
過氧化物酶活性 [u/ （ g ? min ） ]=式中：δ a 470 ——反應時間內(nèi)吸光度的變化.w ——植物鮮重,g .
v t ——提取酶液總體積,ml .
v s ——測定時取用酶液體積 ,ml .
t ——反應時間,min .
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2 ．取光徑 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反應混合液 3 ml 和磷酸緩沖液 1ml ,作為對照,另 1 只中加入反應混合液 3 ml 和上述酶液 1ml （如酶活性過高可稀釋之）,立即開啟秒表記錄時間,于分光光度計上測量波長 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 讀數(shù)一次.
四、結(jié)果計算
以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小,即以 δa 470 /[min ? g （鮮重） ] 表示之.也可以用每 min 內(nèi) a 470 變化 0.01 為 1 個過氧化物酶活性單位（ u ）表示.
過氧化物酶活性 [u/ （ g ? min ） ]=式中：δ a 470 ——反應時間內(nèi)吸光度的變化.w ——植物鮮重,g .
v t ——提取酶液總體積,ml .
v s ——測定時取用酶液體積 ,ml .
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